Improvement of STEAP 1 Biosynthesis from Pichia pastoris X33 cells under an optimized feeding strategy

Prostate cancer (PCa) is the most common type of cancer in aged men. Actually, the main problem arises from the fact that both PCa diagnosis and therapy are still invasive and limited in advanced stages of this disease. Thus, it is necessary to identify, study and characterize specific proteins whose expression correlates with these pathologies. Concerning this, it has been suggested that the Six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 1 (STEAP1) protein as a good biomarker and/or immunotherapeutic target for PCa. It is located in the plasma membrane of epithelial cells, in both tight and gap junctions. STEAP1 is composed of six transmembrane domains, connected by three extracellular and two intracellular loops. Therefore, it has been suggested that this protein plays an important role in intracellular communication between cancer cells, contributing to the cancer process and tumor invasiveness. The characterization of STEAP1 structure and function might allow the development of specific inhibitors, envisaging a decrease of its oncogenic role. However, the techniques used for protein structural and functional characterization demand for high quantities of the target protein, which may be achieved through the recombinant DNA technology. Therefore, the aim of this work was to improve STEAP1 biosynthesis from mini-bioreactor Pichia pastoris X33 methanol induced cultures. This was achieved through the study of different glycerol and methanol feeding profiles during the fed-batch phases. Briefly, the medium supplementation with Proline 1M in a gradient glycerol and constant methanol feed, leads to high quantities of STEAP1 (increase for the double). An exponential glycerol and constant methanol feed produces fewer amounts of the protein but in the correct molecular weight (~35kDa). The influence of the fermentation conditions on STEAP1 molecular weight and N-glycosylation was studied using the enzyme PNGase F. The results showed that a constant glycerol feed seems to produce STEAP1 with N-glycosylation. However, the dimers produced in the gradient glycerol feed are not due N-glycosylation process. Two-dimensional electrophoresis proves this, and it was demonstrated that they correspond to different N-glycosylation patterns. Overall, it was successfully optimized a new strategy for recombinant STEAP1 biosynthesis, through the study of different feeding profiles. Future work encompassing will be developed an alternative strategy to perform the purification on the target protein.O cancro da próstata é uma das patologias com maior incidência em todo o mundo. Atualmente, os meios de diagnóstico e terapêuticos existentes são invasivos e apresentam uma eficácia limitada sobretudo em estágios mais avançados da doença. Desta forma, torna-se necessário o estudo de proteínas específicas cuja expressão esteja relacionada com o seu desenvolvimento e progressão. Diversos estudos têm sugerido a proteína Six-transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate 1 (STEAP1) como um possível biomarcador e/ou alvo imunoterapêutico para o cancro da próstata. A STEAP1 é constituída por 6 domínios transmembranares e encontra-se presente na membrana plasmática das células epiteliais, nomeadamente nas junções que promovem a comunicação célula-célula. Alguns estudos suportam a hipótese que a STEAP 1 assume um papel preponderante na comunicação entre células tumorais, estando desta forma envolvida na progressão do cancro. No entanto, estudos complementares são ainda necessários para resolver a sua estrutura tridimensional de forma a melhor compreender as suas funções na carcinogénese assim como delinear novas estratégias terapêuticas. Deste modo, elevadas quantidades de STEAP1 são requeridas a partir de tecnologias emergentes de DNA recombinante. Nestes domínios, a levedura Pichia pastoris tem-se revelado um hospedeiro adequado na expressão de proteínas recombinantes. Em particular, a sua capacidade para realizar modificações pós-tradução torna-a num sistema microbiano ideal para a produção recombinante de proteínas membranares. Assim, os principais objetivos do presente trabalho são: 1) Aumentar a escala de produção da proteína STEAP1 para bioreator em culturas de Pichia pastoris X33 testando diferentes feeds de glicerol e metanol; 2) Avaliar a adição de diferentes chaperones químicos que contribuam para a estabilização conformacional da STEAP1; 3) Estudar a influência dos diferentes feeds de glicerol em eventuais processos de N-glicosilação. Os resultados obtidos demonstraram que - através um feed por gradiente de glicerol e constante de metanol - houve um aumento da produção de STEAP1, para cerca do dobro, aquando a suplementação do meio com 1M de Prolina. Observa-se que na aplicação de um feed exponencial de glicerol e constante de metanol, a quantidade de STEAP1 produzida encontra-se no peso molecular correto (~35kDa), embora se tivesse verificado níveis de produção reduzidos. Adicionalmente, denotou-se através da digestão dos lisados com a enzima PNGase F que um feed constante de glicerol e metanol parece produzir STEAP1 com N-glicosilação. Como trabalho futuro serão desenvolvidas estratégias de purificação da proteína STEAP1

Factors that influence the success of customer relationship management adoption

Mestrado em Ciências EmpresariaisThe global market is constantly evolving which means companies need to continuously innovate their businesses and understand new ways to keep in touch with their customers. One way to do it is by resorting to Information Technologies (IT) such as Customer Relationship Management (CRM). This kind of information system allows companies to gather data from their customers and transform it into information they can use to better achieve any expectations their clients may have while engaging in closer relationships with them. However, not all companies can successfully adopt or implement a CRM system, and because of that, they may lose their investments or worse, their customers. The purpose of this research is to find an answer to the question – What factors can help companies adopt a successful CRM system? To answer it, it is necessary to understand what aspects marketing and information systems (IS) professionals think as essential to successfully adopt the system. To accomplish this, we build two instruments based on a previous work (Pedron, 2009) in which a set of fundamental objectives (23) and a set of means objectives (49) were identified as influencing factors of a successful CRM system adoption. Using a sample of about 200 professionals we applied Churchill’s (1979) recommendations regarding the item’s purification. All data gathered was analysed through exploratory factor analysis and, consequently, an output resulted with all the factors perceived as important by the professionals that can indeed help with the adoption of a CRM system. Although there are several studies about CRM adoption they are mainly exploratory. Indeed, no measures of CRM adoption success have been previously proposed. This study tries to fulfil this gap in the literature by proposing and validating two instruments for assessing the CRM adoption success.O mercado mundial está em constante evolução, o que significa que as empresas necessitam de continuamente inovar os seus negócios e passar a entender novas formas para se manter em contato com os seus clientes. Uma forma de o fazer é através do recurso às Tecnologias de Informação (TI), como é o caso do Customer Relationship Management (CRM). Este tipo de sistema de informação permite que as empresas recolham dados dos seus clientes e transformem-nos em informação que poderão usar para conseguir atingir da melhor forma as suas expectativas, ao mesmo tempo que se tentam relacionar de forma mais estreita com estes. No entanto, nem todas as empresas conseguem adotar ou implementar um sistema de CRM com sucesso, e por isso, arriscam-se a perder investimentos ou pior, clientes. O objetivo deste trabalho é o de encontrar uma resposta para a pergunta - Quais os fatores que podem ajudar as empresas a adotar um sistema de CRM de sucesso? Para responder a essa questão, é necessário entender quais os aspetos que tanto profissionais de marketing como de sistemas de informação (SI) têm como essencial para adotar com sucesso o sistema. Para tal, vamos construir dois instrumentos com base num trabalho anterior (Pedron, 2009), no qual um conjunto de fundamental objectives (23) e um conjunto de mean objectives (49) foram identificados como fatores influenciadores para uma correta adoção do sistema CRM. Através de uma amostra de cerca de 200 profissionais utilizámos as recomendações de Churchill (1979) sobre a purificação de itens. Todos os dados recolhidos foram analisados por meio da análise fatorial exploratória, do qual resultou um output composto por todos os fatores percebidos como importantes pelos profissionais que podem realmente ajudar na adoção de um sistema de CRM. Embora haja vários estudos sobre a adoção de CRM estes são principalmente exploratórios. Ainda nenhuma forma de medição de sucesso da adoção do CRM foi até então proposta. Este estudo tenta preencher essa lacuna na literatura, propondo e validando dois instrumentos para avaliar o sucesso da adoção do CRM

The role of GSH signaling in mitophagy induced by reactive oxygen species: potential target for neuroprotection in stroke?

Mitochondria are involved in numerous cellular processes, including energy production and cell death regulation. Simultaneously, these are the main cellular producers of reactive oxygen species (ROS), particularly when dysfunctional. ROS accumulation leads to oxidative stress which is associated with pathologies, such as stroke and neurodegenerative diseases. So, elimination of ROS-producing damaged mitochondria is key for maintaining cell homeostasis. Mitophagy, consists of the selective degradation of excessive or damaged mitochondria. The accumulation of ROS and mitochondrial depolarization stimulates PTEN-induced kinase 1 (PINK1)/PARKIN-mediated mitophagy. Concomitantly, ROS are counteracted by glutathione, a key antioxidant. ROS oxidize glutathione and stimulate protein S-glutathionylation, a post- translation modification capable of modulate protein function. Here, the main goal was to ex- plore the molecular mechanisms underlying mitophagy, in particular the role of ROS and/or glutathione signaling in mitophagy progression, with a special focus on protein S-glutathi- onylation. We hypothesized that mitophagy can be regulated by glutathione signaling, namely that the accumulation of mitochondrial ROS stimulates the production and oxidation of gluta- thione, which enhances/stimulates mitophagy by protein glutathionylation of mitophagy-re- lated proteins. Using human cell lines, SH-SY5Y and SH-SY5Y mitoQC, mitochondrial dysfunc- tion was stimulated with the classical uncoupler carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). ROS generation and PINK1/PARKIN-dependent mitophagy were observed after CCCP treatment. Likewise, the catalytic subunit of the rate limiting enzyme for glutathione synthesis, Glutamate-Cysteine Ligase, is upregulated in CCCP-treated cells. Notably, we show for the first time that CCCP treatment induces protein S-glutathionylation of PINK1. Furthermore, we also found fluorescence measure on a microplate reader to be a possible new technique to assess mitophagy. Understating mitophagy mechanisms and how these are regulated is key to stimulate cytoprotection by preventing cell death. Thus, this can eventually contribute to new strategies against diseases characterized by mitochondrial damage, like stroke.As mitocôndrias são essenciais em processos celulares como produção de energia e regulação da morte celular. Simultaneamente, são as principais produtoras de espécies reativas de oxigênio (ROS), particularmente quando disfuncionais. A acumulação de ROS leva a stress oxidativo que está associado a patologias, como acidente vascular cerebral e doenças neuro- degenerativas. Assim, a eliminação de mitocôndrias danificadas produtoras de ROS é funda- mental para a homeostase celular. A mitofagia consiste na degradação seletiva de mitocôn- drias excessivas ou danificadas. Acumulação de ROS e despolarização mitocondrial estimulam mitofagia via quinase 1 induzida por PTEN (PINK1)/PARKIN. Concomitantemente, ROS são neutralizados pela glutationa, um antioxidante chave. As ROS oxidam a glutationa e estimulam s-glutationilização, uma modificação pós-traducional capaz de modular a função proteica. Aqui, o objetivo foi explorar os mecanismos subjacentes à mitofagia, particularmente o papel da sinalização de ROS e/ou glutationa na progressão da mitofagia, com foco especial na s- glutationilização. Colocamos a hipótese que a mitofagia pode ser regulada pela sinalização da glutationa, nomeadamente que a acumulação de ROS mitocondriais estimula a produção e oxidação de glutationa, que estimula a mitofagia por S-glutationilização de proteínas relacio- nadas com mitofagia. Em linhas celulares humanas, SH-SY5Y e SH-SY5Y mitoQC, disfunção mitocondrial foi estimulada com carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Geração de ROS e mitofagia dependente de PINK1/PARKIN foram observados após tratamento com CCCP. Igualmente, a subunidade catalítica da enzima limitante da síntese de glutationa, Gluta- mato-Cisteína Ligase, é sobre-expressa em células tratadas com CCCP. Notavelmente, mostra- mos que tratamento com CCCP induz glutationilização de PINK1. Além disso, também desco- brimos que medir fluorescência num leitor de microplacas é uma possível técnica para avaliar mitofagia. Compreender os mecanismos de mitofagia e como são regulados é fundamental para estimular a citoproteção prevenindo a morte celular. E eventualmente contribuir para novas estratégias contra doenças caracterizadas por danos mitocondriais, como o acidente vascular cerebral

The potential cost-effectiveness of quadrivalent versus trivalent inactivated influenza vaccine for the portuguese elderly population

Trabalho de Projeto de Mestrado em Bioestatística, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019A gripe sazonal é uma doença respiratória aguda que afeta as vias respiratórias e é provocada pelo vírus Influenza, sendo caracterizada por sintomas como febre, tosse, dores musculares e articulares e dores de cabeça. As epidemias ocorrem anualmente, principalmente no inverno e um dos grupos mais afetados são os indivíduos com idade igual ou superior a 65 anos. A vacinação é a forma mais eficaz de proteção contra a infeção pelo vírus. Ao longo do tempo, é esperado que as vacinas inativadas tetravalentes venham a substituir as vacinas inativadas trivalentes. Em Portugal, as vacinas trivalentes são totalmente comparticipadas pelo Serviço Nacional de Saúde para grupos de risco, onde se incluem indivíduos com idade igual ou superior a 65 anos. Estas contêm duas estirpes de vírus influenza do tipo A e uma estirpe da linhagem B. Por sua vez, as vacinas tetravalentes foram recentemente lançadas no mercado, em outubro de 2018, e oferecem maior proteção, já que contêm uma estirpe adicional da linhagem B. O principal objetivo deste trabalho consistiu em adaptar o modelo desenvolvido pela Universidade Francisco de Vitoria ao contexto português, de forma a estimar a relação custo-efetividade associada à substituição das vacinas trivalentes pelas vacinas tetravalentes, na perspetiva do Serviço Nacional de Saúde (SNS). Para além disso, pretende-se também individualizar os custos por regiões NUTS II (Norte, Centro, Lisboa e Vale do Tejo, Alentejo e Algarve), considerando diferentes quotas de mercado. Para avaliar a relação custo-efetividade da substituição das vacinas tetravalentes pelas trivalentes, foi utilizado um modelo de árvore de decisão onde o grupo alvo foi a população de Portugal Continental com idade igual ou superior a 65 anos. Foi considerado um horizonte temporal de 1 ano, uma vez que as epidemias de gripe se repetem anualmente. A medida de efeito considerada correspondeu ao Quality Adjusted Life Year (QALY), que mede os ganhos de saúde em quantidade e em qualidade, referindo-se à mortalidade e morbilidade, respetivamente. A árvore de decisão começa por ter em conta se os indivíduos foram vacinados, uma vez que a vacina contra o vírus influenza deve ser administrada no início de cada época gripal. De seguida, verifica se os indivíduos desenvolveram síndrome gripal, e posteriormente se têm gripe confirmada. Para os casos de gripe confirmada, é tido em conta se foi diagnosticada no contexto de consulta em Cuidados de Saúde Primários, hospitalização devido a pneumonia, doença respiratória ou doença cardíaca. Se a gripe foi diagnosticada em contexto de consulta, de seguida considera-se se evoluiu para hospitalização. Os pontos terminais dos caminhos da árvore de decisão dividem-se em: “Morte” ou “Saudável”, sendo que o último inclui todos os indivíduos que não morreram, independentemente da sua condição. A árvore de decisão foi alimentada por probabilidades, custos e QALYs. Para cada caminho da árvore foram calculados os custos e QALYs esperados. O total destas duas medidas permite o cálculo do Rácio de Custo-efetividade Incremental (RCEI), o qual resulta da razão entre a diferença em custos entre as duas vacinas e a diferença em efeitos. Os dados de internamento foram extraídos da base de dados central de morbilidade hospital, sendo referentes à época gripal de 2015/16 e permitiram calcular as probabilidades de hospitalização e subsequente morte e custos associados. Os restantes dados foram extraídos de diversas fontes tais como: o Instituto Nacional de Estatística, relatórios divulgados pelo Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, entre outros. Uma das principais fontes de incerteza no modelo é a incerteza paramétrica que resulta da estimação de parâmetros baseada em amostras. Desta forma, a análise de sensibilidade foi realizada de forma a, por um lado, encontrar os parâmetros com maior impacto na variação do RCEI, através da análise de sensibilidade univariada, e por outro, avaliar a robustez dos resultados do caso base, através da análise de sensibilidade probabilística. A primeira análise referida incluiu todos os parâmetros do modelo, e quando conhecido, foi considerado o intervalo de confiança, caso contrário foram considerados os limites ±20% do seu valor do caso base. Assim, os valores dos limites inferiores e superiores considerados, foram substituídos no modelo de forma a estimar o RCEI e os resultados foram apresentados através de um diagrama de tornado, o qual ordena os parâmetros desde o de maior impacto até ao de menor impacto no RCEI. A análise de sensibilidade probabilística avaliou a robustez dos parâmetros do caso base, nomeadamente dos parâmetros estimados com base em amostras, uma vez que os restantes se referem à população de 2015/16, não trazendo incerteza ao modelo para essa época gripal. Foi atribuída uma distribuição de probabilidade a cada um dos parâmetros em questão e foram realizadas 1000 simulações de Monte Carlo. Em cada iteração foi simulado um valor para os parâmetros com incerteza – valor probabilístico - com base na distribuição de probabilidade atribuída e os resultados do modelo foram guardados. Este processo teve como base o Teorema da Transformação Integral de Probabilidade. Para as probabilidades, foi atribuída a distribuição Beta, em que os parâmetros α e β foram estimados através do Método dos Momentos usando a média e o desvio-padrão da amostra. De forma semelhante, para as disutilidades foi atribuída a distribuição Gamma e Lognormal e os resultados foram comparados para perceber qual a distribuição que produzia menor variabilidade. Mais uma vez, recorreu-se ao método dos momentos para estimar os parâmetros das distribuições a partir da média e do desvio-padrão da amostra. Para a efetividade, tendo em conta que é calculada a partir de um Risco Relativo, foi aplicada a distribuição Lognormal. Os resultados da análise probabilística foram apresentados no plano Custo-efetividade e permitiram, ainda, traçar a curva de aceitabilidade de custo-efetividade (CACE) usando a medida Net Benefit. Esta medida permite a uniformização da escala entre custos e efeitos, podendo ser Net Monetary Benefit ou Net Health Benefit. Por fim, a CACE estabelece a probabilidade de uma vacina ser custo-efetiva para vários limites considerados. De forma a individualizar os custos por regiões NUTS II, foram considerados vários cenários de quotas de mercado, nomeadamente, o cenário atual do SNS – 100% de quota de mercado para as vacinas trivalentes, um cenário de 50%-50% e ainda um cenário de 100% de quota para as vacinas tetravalentes. De acordo com o modelo, a mudança para as vacinas tetravalentes levaria a que cerca de 37 casos de gripe confirmados, cinco hospitalizações e uma morte pudessem ter sido evitados na época de 2015/16 em pessoas com idade igual ou superior a 65 anos, resultando numa poupança de 20,695€ para o SNS. Contudo, o custo mais elevado da vacina tetravalente levaria a um incremento total de 2,848,924€ e um RCEI de 14,242,844€/QALY, bem acima dos limites usuais. A análise probabilística reforçou as conclusões do caso base, tendo o intervalo a 95% para o RCEI sido estimado a (7,047,221; 46,191,560). A análise univariada permitiu identificar a disutilidade associada a ter síndrome gripal sem confirmação de gripe e o custo da vacina tetravalente como os parâmetros mais sensíveis do modelo. A região Norte foi identificada como a região com os custos mais elevados, enquanto que a região Centro é a região com maior diferença em efeitos para todos os cenários. Da perspetiva do SNS, as vacinas tetravalentes não são custo-efetivas para indivíduos com idade igual ou superior a 65 anos. No entanto, mais investigação deve ser realizada no sentido de perceber o impacto das vacinas tetravalentes, não só para o SNS como a nível social.Quadrivalent Inactivated Vaccines (QIV) are expected to replace Trivalent Inactivated Vaccines (TIV) over time. In Portugal, TIV is free of charge for risk groups, where the elderly are included. On its turn, QIV was recently launched in October 2018 and provides wider protection as it includes an additional lineage B strain. The main objectives of this project were to adapt the model developed by Universidad Francisco de Vitoria to the Portuguese elderly population in order to estimate the potential cost-effectiveness of switching from TIV to QIV from the National Health Service (NHS) perspective. A decision tree model was created and data on Hospitalizations in the 2015/16 season were extracted from the National Database on Hospital Morbidity and used to inform the model. Both alternatives were compared. A one-way sensitivity analysis was performed to find the parameters with the biggest impact on ICER, and a probabilistic sensitivity analysis allowed to evaluate the robustness of the base case results. By switching from TIV to QIV, the model estimated that about 37 confirmed influenza cases, five hospitalizations and one death could have been averted in the 2015/16 season in the elderly, resulting in a cost-saving of 20,695€. However, the higher cost of QIV would lead to a total increment of 2,848,924€ and the resulting ICER would be 14,242,844€/QALY, largely above the usual cost-effectiveness thresholds. PSA results reinforced the base case conclusions, with an 95% interval estimate of (7,047,221; 46,191,560) for ICER, also not including the usual acceptable values. One-Way Sensitivity Analysis (OWSA) allowed to find the disutility associated with ILI when no confirmed influenza and the cost of quadrivalent vaccine as the parameters most sensitive for ICER. From the NHS, this study concluded that QIV is not cost-effective for the elderly population

Microspa – gut microbiota and axial spondyloarthritis : the impact on anti-tnf therapy

Background: The etiopathogenesis of axial spondyloarthritis (axSpA) is not completely understood and growing evidence suggests that gut microbiota could play an important role in the initiation and progression of axSpA. The introduction of anti-Tumor Necrosis Factor (anti-TNF) therapy has revolutionized the treatment of axSpA in patients, however a significant proportion of patients do not respond to these costly drugs. Thus, it is urgent and necessary to understand the factors that impact the response to therapy and identify new predictors of therapeutic efficacy. Aim: To evaluate the relationship between fecal microbiota composition and anti-TNF therapy in Portuguese axSpA patients with high levels of disease activity. In addition, fecal microbiota composition was characterized and associations between bacterial taxa and disease activity were explored. Methodology: This pilot is a 14-week prospective observational study that included axSpA patients with indication for anti-TNF therapy referenced from Hospital de Egas Moniz. A total of two fecal samples from each patient was collected at baseline and after 14 weeks on anti-TNF treatment. Bacterial DNA present was extracted from samples and specific bacterial groups were identified and quantified by 16S rDNA sequencing. axSpA activity was assessed at each time point using Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score with C-Reactive Protein (ASDAS-CRP) and Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI) scores. Results: We observed that adalimumab (anti-TNF drug) impacts fecal microbiota composition shifting the abundance of specific genera by increasing abundance of Bifidobacterium, Butyrivibrio, Pseudobutyrivibrio, Eubacterium and Sutterella and decreasing abundance of Porphyromonas. Porphyromonas was identified as a biomarker of disease activity. Our findings reinforced previous observations that patients with higher inflammatory status and higher disease activity are more likely to respond to anti-TNF treatment. Our investigation suggested that the fecal microbiota may be a potential tool for predicting the treatment response to adalimumab in axSpA patients, as fecal microbiota characterized by higher abundance of Anaerovorax, Coprococcus, Lautropia, Rothia, Saccharothrix, Succiniclasticum and Veillonella was associated with failure to respond to treatment and SpA patients may respond to anti-TNF treatment more effectively if they exhibit increased bacterial richness and increased abundances of Gemmatimonadetes, Atopobium, Burkholderia and Escheria. Conclusion: This pilot study revealed interesting preliminary data on fecal microbiota features in Portuguese axSpA patients, provided insights into the dynamic microbiota alterations after 14 weeks of adalimumab treatment and identified microbial biomarkers of treatment response that could pave the way to development of precision therapy in axSpA

Stabilization of COMT by experimental design approaches

Catechol-O-methyltransferase (COMT) is monomeric enzyme magnesium dependent that is involved in the inactivation of catechol substrates such as dopamine, epinephrine and norepinephrine. The COMT enzyme is present as two isoforms, a soluble isoform (SCOMT) that is found in the cytoplasm and a membrane-bound isoform (MBCOMT) which is present mainly in the rough endoplasmatic reticulum membrane. Both isoforms are extremely thermolabile and, except for catechol estrogens, which possess similar KM values for both isoforms, MBCOMT presents higher affinity (lower KM) for the catechol substrates. In the last years, these enzymes have been described as being involved in several human diseases such as catechol-estrogen induced cancers, cardiovascular diseases and degenerative brain disorders. Actually, the most effective treatment for Parkinson’s disease is a triple prophylaxis consisting of the dopamine replacement with levodopa together with an inhibitor of aromatic amino acid decarboxylase and an inhibitor of COMT. Since both COMT isoforms are present in tissues at low concentrations, in order to accomplish its structural or functional characterization, these enzymes are usually expressed in a recombinant form using a suitable host, in which the final aim is the achievement of protein extracts with enough quantity and purity, enabling structural and functional studies. Specifically, in this work, it was intended to establish a formulation that allows the storage of recombinant and biologically active MBCOMT in a native state from Pichia pastoris lysates. Therefore, it was applied a design of experiments (DOE) in order to obtain the optimum conditions for MBCOMT storage according to the stabilizers concentrations (trehalose, glycerol and cysteine), the storage temperature (-80 ºC, -20 ºC and 4 ºC) and the storage time (24, 48 and 72 hours). The global aim of this work was to establish the optimum storage conditions that allow MBCOMT to maintain its biological activity in a native state for as long as possible without compromising its biological activity. Thus, in order to achieve this aim, an artificial neural network was created where by the analysis of the response surface graphics, a specific run (optimum point) was obtained where the percentage of the MBCOMT biological activity recovery was the highest (114.56 %). Therefore, a specific formulation with 100 mM trehalose, 30 % (v/v) glycerol and 150 mM cysteine allow MBCOMT stabilization during 72 hours at 4 ºC, as judged by the slightly improvement in MBCOMT biological activity at 72 hours, when compared with the MBCOMT biological activity obtained immediately after cell lysis (0 hours). In conclusion, for the first time, a systematic study was carried out in order to evaluate the best conditions to storage recombinant MBCOMT, allowing to obtain a specific formulation that maintain MBCOMT in a native and biologically active state during 72 hours.A catecol-O-metiltransferase (COMT) é uma enzima monomérica dependente de magnésio envolvida na inativação de substratos com estrutura catecólica como a dopamina, epinefrina e norepinefrina. A COMT apresenta-se sob duas formas, uma isoforma solúvel (SCOMT) cuja localização é o citoplasma e uma isoforma membranar (MBCOMT) que se encontra predominantemente na membrana do retículo endoplasmático rugoso. Ambas as isoformas são extremamente termolábeis, sendo que a MBCOMT apresenta maior afinidade (menor KM) para todos os seus substratos, com exceção dos estrogénios com estrutura catecólica. Adicionalmente, tem sido descrito que estas enzimas possuem um papel importante em diversas patologias humanas tais como cancros induzidos por estrogénios, doenças cardiovasculares ou doenças neurodegenerativas. Atualmente, a terapêutica para a doença de Parkinson consiste numa tripla profilaxia incluindo levodopa, um inibidor da enzima descarboxilase dos aminoácidos aromáticos e um inibidor da COMT. Visto que ambas as isoformas são expressas em baixos níveis nos tecidos, para ser possível a sua caracterização estrutural ou funcional (que permita por exemplo, o desenvolvimentos de novos inibidores com potência e eficácia melhoradas), geralmente estas enzimas são expressas de forma recombinante utilizando um microrganismo adequado, tendo como objetivo final a obtenção de extratos proteicos em quantidade suficiente e pureza adequada que permita a realização dos estudos anteriormente mencionados. Em particular, neste trabalho, pretendeu-se estabelecer uma formulação que permita o armazenamento da MBCOMT recombinante no seu estado nativo e, consequentemente, com atividade biológica obtida a partir de lisados de Pichia pastoris. Sendo assim, foi aplicado um desenho experimental (DOE) de forma a poder encontrar as condições ótimas de armazenamento da MBCOMT em termos da concentração dos estabilizadores (trealose, glicerol e cisteína), temperatura (-80, -20 e 4ºC) e tempo de armazenamento (24, 48 e 72h). Com este trabalho pretendeu-se encontrar as condições ótimas de armazenamento que permitam manter a MBCOMT num estado nativo pelo máximo tempo possível sem comprometer a sua atividade biológica. Para alcançar este objetivo foi criada uma rede neuronal onde através da análise dos gráficos de resposta de superfície, foi-nos dado o ponto ótimo onde a percentagem de recuperação de atividade biológica da MBCOMT foi máxima (114.56 %). Assim sendo, uma formulação contendo 100 mM Trealose, 30 %(v/v) Glicerol e 150 mM Cisteína permitiu a estabilização da MBCOMT recombinante durante 72 horas a 4 ºC, como foi comprovado pelo ligeiro aumento na atividade biológica da MBCOMT às 72 horas, em comparação com os valores obtidos imediatamente após a lise celular (0 horas). Em conclusão, pela primeira vez efetuou-se um estudo sistemático acerca das melhores condições para o armazenamento da MBCOMT recombinante, permitindo obter uma formulação que mantém a MBCOMT num estado nativo e biologicamente ativo durante 72 horas

Analysis of the alterations induced by working memory tasks in the electroencephalogram

The working memory (WM) is an essential cognitive function with limited capability that allows the temporary storage and manipulation of information used in complex cognitive tasks. The Fluid Intelligence (FI) is the ability to engage and respond to new situations, regardless of previous knowledge.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Levantamento Epidemiológico das Epilepsias/Síndromes epilépticos - Que realidade em Portugal?

A Epilepsia apresenta-se como uma doença milenar, objeto de grandes transformações concetuais ao longo dos tempos. Atualmente constitui uma das patologias neurológicas crónicas mais frequentes, com pico de manifestação nos primeiros anos de vida e na velhice. As suas formas de apresentação são múltiplas e as repercussões físicas e cognitivas podem variar entre mínimas, quase impercetíveis, até algo mais global com limitações explícitas na vida quotidiana dos doentes e seus familiares. Os dados epidemiológicos adstritos a esta patologia são escassos e ao mesmo tempo inconsistentes, mesmo nos países desenvolvidos. De uma forma global, não existem políticas científicas de registo sistematizado destes doentes, nem metodologias homogéneas ou bases de dados uniformizadas a nível internacional. O presente trabalho, após realizar uma contextualização teórica ao nível da patologia aqui em análise e de conceitos e ideologias epidemiológicas, expõe, de forma sintetizada, os dados publicados em artigos científicos, referentes a países desenvolvidos e em vias de desenvolvimento. Salienta-se a situação portuguesa com informação ínfima nesta matéria e pouco atual. Assim, com base na literatura analisada e na experiência clínica e técnica, desenvolveu-se uma proposta de base de dados para registo destes doentes, que permite a inserção de diversas informações relevantes, para além dos dados diretos adstritos à Epilepsia ou Síndromes Epilépticos, a sua contabilização e filtragem, consoante a finalidade pretendida. Realça-se o seu fácil preenchimento, num formato digital aplicável a qualquer meio informático, sem custos adicionais. Só através de uma prática nacional sistematizada de registo da doença se poderão desenvolver políticas de saúde que permitam uma melhor gestão da mesma, com melhoria da qualidade dos serviços de saúde prestados, de tratamentos mais adequados e novas hipóteses de investigação na área, com posterior aumento da qualidade de vida dos doentes